Kweken van Micro-organismen

Nutriënten

Micro-organismen hebben nutriënten nodig als bouwstenen voor celonderdelen en voor hun groei. De beschikbaarheid en samenstelling van deze nutriënten beïnvloeden direct de groei van micro-organismen.

• Essentiële elementen: H, C, N, O, P, S, Se

• Macronutriënten: Koolhydraten, eiwitten, lipiden

• Micronutriënten: Organische of anorganische stoffen zoals vitamines (bijv. foliumzuur, aminozuren) en mineralen (bijv. calcium (Ca), ijzer (Fe))

Kweekmedium voor Groei van Micro-organismen

Een kweekmedium is een voedzaam materiaal, samengesteld om micro-organismen in het laboratorium te laten groeien. De samenstelling hangt af van de behoeften van het micro-organisme.

• Sommige bacteriën groeien in bijna elk kweekmedium

• Andere bacteriën vereisen een speciaal kweekmedium

• Sommige micro-organismen zijn (nog) niet op een medium te kweken

Soorten Kweekmedia

Kweekmedia kunnen worden ingedeeld op basis van hun samenstelling en doel:

Bestanddelen van het Kweekmedium

• Nutriënten:

  • Koolstofbron (C-bron)

  • Stikstofbron (N-bron)

  • Mix van overige nutriënten (= groeifactoren)

• Agar: Alleen voor vaste media, als bindmiddel

• pH-indicator: Voor het monitoren van pH-veranderingen

• Buffer: Voor het behouden van een optimale pH

• Selectieve en/of electieve stoffen: Voor het selecteren of identificeren van specifieke micro-organismen

Koolstofbron

• Koolstof is ongeveer 50% van het drooggewicht van een cel

• Meest gangbare micro-organismen gebruiken de koolstofbron ook als energiebron

• Voorbeelden:

  • Monosacharide: glucose

  • Disacharide: lactose of sucrose

  • Polysacharide: zetmeel

• Autotrofe micro-organismen gebruiken CO2 als voornaamste koolstofbron

• Opmerking: Afbraak van suikers leidt vaak tot vorming van zuren (daling pH) en/of gassen (CO2 en H2)

Stikstofbron

• Stikstof is ongeveer 17% van het drooggewicht van een cel

• Pepton (gehydrolyseerd eiwit) wordt vaak gebruikt als bron

• Eiwitten worden afgebroken tot polypeptiden, peptiden en aminozuren

• Veel micro-organismen hebben weinig proteolytische enzymen, dus worden aminozuren vaak direct toegevoegd

• Opmerking: Afbraak van pepton leidt tot vorming van basische verbindingen zoals NH3 en NH4+, wat een stijging van de pH veroorzaakt

Groeifactoren en Agar

• Groeifactoren: Mix van overige nutriënten zoals gistextract, vleesextract, vitamines en micro-elementen

• Agar: Bindmiddel voor kweekmedia, geschikt voor gestold medium (platen of buizen), gemaakt van zeewier

Groei van Micro-organismen

Generatietijd en Groeicurve

De generatietijd is de tijd die nodig is voor een populatie om te verdubbelen. Dit verschilt per organisme en is afhankelijk van het groeimedium en de incubatiecondities.

• Snelle generatietijd: 0,3 - 6 uur (bijvoorbeeld E. coli: 20 min)

• Lange generatietijd: dagen tot weken

De groei van micro-organismen wordt vaak weergegeven in een groeicurve met verschillende fasen:

1. Lag-fase: Gewenning aan het nieuwe medium, enzymen worden gesynthetiseerd

2. Exponentiële (log) fase: Snelle, exponentiële groei

3. Stationaire fase: Aantal cellen blijft constant; groei = sterfte, nutriënten raken op

4. Afdodende fase: Voedingsstoffen raken op, afvalproducten hopen op, cellen sterven

Functies voor Exponentiële Groei

Exponentiële groei van een populatie kan wiskundig worden beschreven met de volgende formules:

• waarbij: N = aantal cellen na n generaties N0 = aantal cellen bij aanvang n = aantal delingscycli

• Logaritmische vorm:

• Generatietijd (): tijd nodig om het aantal cellen te verdubbelen

• Groeisnelheidsconstante (): maat voor groeisnelheid per tijdseenheid

• Relatie:

Groei van Micro-organismen in de Praktijk

In het laboratorium kan de groei van micro-organismen op verschillende manieren worden bepaald:

• Directe microscopische telling (telkamer)

• Uitplaten op agar (spreidplaat, gietplaat)

• Troebelheidsmeting met een spectrofotometer

• Bepaling van biomassa (nat of droog gewicht)

De gekozen parameter (aantal cellen, troebelheid, aantal kolonies, biomassa) is recht evenredig met het aantal cellen.

Groeibepalende Factoren

De groei van micro-organismen wordt beïnvloed door verschillende omgevingsfactoren:

• Temperatuur: Enzymatische reacties verlopen sneller bij hogere temperaturen tot een optimum; te hoge of te lage temperaturen kunnen de cel beschadigen of doden.

• pH: Micro-organismen worden ingedeeld op basis van hun optimale pH:

  • Acidofiel: pH < 5,5

  • Neutrofiel: pH 5,5 - 8

  • Alkalifiel: pH > 8

• Waterbeschikbaarheid (aw): Relatie tussen dampspanning van water in het medium en puur water (aw = 1 voor puur water). Groeigrens voor de meeste bacteriën: aw > 0,9.

• Zuurstof: Micro-organismen kunnen worden ingedeeld als obligaat aeroob, microaerofiel, facultatief (an)aeroob, aerotolerant anaeroben, of obligaat anaeroben.

Afdoding van Micro-organismen

Begrippen en Methoden

Het afdoden van micro-organismen is essentieel voor hygiëne en veiligheid. Belangrijke begrippen zijn:

• Desinfecteren: Terugbrengen van het aantal micro-organismen tot een aanvaardbaar niveau

• Steriliseren: Doden van alle micro-organismen en hun sporen

• Desinfectantia: Chemische middelen met bacteriocide werking

Fysische Methoden voor Afdoding

• Temperatuur:

  • Pasteuriseren: Kort verhitten (60-80°C, enkele minuten), doodt vegetatieve cellen

  • Steriliseren (autoclaveren): 15 min bij 121°C, doodt ook sporen

• Straling: UV-straling (oppervlakken), gamma-straling (kruiden)

• Filtratie: Voor hittegevoelige vloeistoffen/gassen; poriegrootte 0,2-0,45 μm

Decimale Reductietijd (D-waarde)

De decimale reductietijd (D-waarde) is de tijd die nodig is om 90% van de micro-organismen af te doden bij een bepaalde temperatuur.

• Formule:

• Hoe lager de D-waarde, hoe sneller de afdoding

Chemische Methoden voor Afdoding

• Antimicrobiële agentia: Natuurlijke of synthetische chemicaliën die micro-organismen doden of remmen

• Antibioticum: Natuurlijke verbinding, geproduceerd door micro-organismen, werkzaam tegen andere micro-organismen

• Chemotherapeuticum: Kunstmatige verbinding, werkzaam tegen micro-organismen

Testen van Antimicrobiële Activiteit

• MIC-waarde: Minimum Inhibitory Concentration, laagste concentratie die groei remt

• Agar-diffusiemethode: Test voor gevoeligheid van micro-organismen voor antimicrobiële middelen

• Standaardtests: Europese suspensietest, 5-5-5 test

Vergelijking Steriliseren vs. Desinfecteren

Voorbeeld: Pasteuriseren van melk: 15 seconden bij 71°C (HTST-methode) doodt vegetatieve cellen, maar niet alle sporen.

Additional info: De besproken onderwerpen zijn fundamenteel voor het begrijpen van microbiële groei en afdoding, en zijn relevant voor studenten in de (bio)chemie, biotechnologie en medische laboratoriumtechnologie.